胶怎么做冰冻切片？

在上一讲中，我们谈到了如何进行石蜡切片。 本次讲座，我们将继续讲述如何进行冰冻切片。

冷冻切片

如果说石蜡切片可以切得很大胆动物切片，那么冰冻切片就比较局限了。 有什么限制？ 答案是：温度。 从字面上看，冷冻切片当然需要比较低的温度，一般为-20℃（-20℃）。 所以冰冻切片的**步准备是打开冷冻切片机进行预冷。 在切片机预冷的一两个小时内，我们可以做其他准备工作，包括：刀片、载玻片（防脱）、OCT胶水、镊子、卷纸、铅笔（这里有一个重要的小动作，请看提示 1). 切记也要在切片机中预冷刀片和镊子，但载玻片不行！ 想！ 放！ 让我解释一下原因。 刀片、镊子和载玻片都与 OCT 胶水直接接触。   OCT 胶水在室温下为液体，在-20°C 下为固体。 我们也说过OCT胶是用来包裹组织外面，帮助切片成型的，所以我们希望理想的状态是切片时刀片和镊子接触OCT胶，保持胶的固态，以保证切片平滑，载玻片在贴片时接触OCT胶水，可瞬间将胶水融化成液态，帮助组织快速粘附在载玻片上。 所以为了实现这个理想，我们需要将刀片和镊子预冷至-20°C，同时将载玻片保持在室温。

图1

冷冻切片机预冷后动物切片，先穿上一件长袖的、较厚的白大衣，尤其是在夏天，因为我们的两只手臂要伸入切片机的-20°C区域进行操作，而且持续时间一般是以小时计算的。 做好保护后，将纸巾从冰箱中取出，放入切片机中低温保存。 在冷冻切片的**步中，组织被固定在冷冻切片机上。 首先取一个自己喜欢的冷冻头（冷冻头一般有好几个，如图2），然后就是一个操作，这个是我自己发明的。 骄傲了好几年，现在无私的向所有fans开放，那就是在冷冻的头上夹一个自制的OCT胶水模具（这个神器怎么做，请参考Tip 2，外观工件如图 3 所示）。 这个整形器是做什么用的？ 让本夏解释一下。 由于组织和冷冻头都是固体，如果我们要将组织固定在冷冻头上，就必须使用液体OCT胶将组织“粘”在冷冻头上。 这一步的具体操作是用镊子将组织夹在冷冻头上，然后挤一些OCT胶完全淹没组织，然后将冷冻头放回冷冻头架上，耐心等待OCT凝胶凝固. 一旦 OCT 凝胶完全凝固，此步骤就完成了。 说了半天，好像不需要OCT glue ，着急啊。 由于OCT胶是凝胶状的，挤到冷冻头上时其边缘是不规则的，导致切片时难以形成规则完整的形状，导致切片不顺畅。 所以此时如果我们使用OCT胶水成型器，我们可以得到边缘整齐的圆形切片，就像方形石蜡切片一样。

图2 冷冻头

图 3 OCT 凝胶形成器

准备标本，将冷冻头和标本固定在切片机上，装上刀片（注意事项参照石蜡切片），开始修片。 是的，冰冻切片也需要修整。 修整中使用的切片厚度可以是 10 μm、15 μm 或更厚。 因为冰冻切片容易融化开裂（这是我的理解），所以官方切片的厚度比石蜡切片稍厚，一般为5μm，甚至有人用10μm。 与石蜡切片不同，每个冰冻切片都是独立切割的（参见此处的提示 4），不会首尾相连，便于修补。 然而，真正方便冰冻切片上片的步骤并不在这里，而是冰冻切片的精髓——冷冻。 刚才我们说了，OCT胶在常温下是液态，-20°C下是固态，所以固态的OCT胶在常温下遇到载玻片，马上就融化了。 这个过程自然地吸收载玻片上的组织。 然后制作冰冻切片。 不需要立即染色的冰冻切片可放入切片盒中并在 -80°C 下保存，直到您记住它们。

关于切片我们已经说了很多。 下一讲，我想告诉大家如何做免疫组化染色。

1.准备工作中列出的所有项目均不包括冷冻头，因为冷冻头默认始终放置在切片机中。 如果小伙伴用过的切片机冷冻头每次用完就拿出来存放（很多公用切片机都会采取这种方式防止私用），请记得预冷切片机时把冷冻头放好. 一起放入切片机预冷，道理同刀片和镊子。

2、前方高能：本夏自制OCT胶水成型机。 取一个20ml的注射器，取下针头和针芯，刻度管留在外面。 请注意，我们需要的是装有针芯的那一端（即注射时食指和中指接触的那一端），而不是装有针头的那一端。 接下来，找一把美工刀或剪刀剪断管子。 低2cm左右，自制的OCT涂胶机就做好了。 最后，找两个最小的长尾夹，将塑形器夹在冷冻头上使用。 每次想起这个神奇的操作，我都忍不住暗自称赞。

3. 冷冻切片机中的多个冷冻头实际上是为了节省切割多个样品的时间。 我们使用 OCT 胶水将组织“粘”到冷冻切片机上。 等待胶水凝固需要一点时间。 如果我们每次等一块纸巾切完，就把纸巾拿走，然后用卷纸擦拭冷冻切片机。 清洁然后准备下一个样品是浪费时间。 因此，在切割多个组织时，使用所有可用的冷冻头，一次冷冻一批组织，然后每切割一个，就空出一个冷冻头。   ，然后冷冻新组织，这样可以节省时间。

4、切冻片和切羊肉卷本质上是一样的，所以有一个现象是一样的，就是切好的片会卷起来。 因此，切片机自带防卷玻璃板，切好的切片会自动压在玻璃板下压平。 不过玻璃板用久了，切下来的切片不一定能准确的插进玻璃板和刀片的缝隙里，所以直接用镊子夹住切片，不过这个操作有点难度，因为它是边切边切的。   ，也就是当刀片刚切下一点点胶水时，镊子就会夹住切片，然后随着刀片的不断切割，镊子引导切片向下，直到切片被完全切开。 如果有朋友不幸遇到了不好用的玻璃板，同时自己也没有那么巧，可以选择切成卷，等卷掉了，用镊子（**弯头）插入卷筒，打开镊子将卷筒摊开，然后保持镊子支撑卷筒（此时卷筒会挂在镊子上），将卷筒放在载玻片上，效果也一样非常好。

5. 剪下的组织用PBS清洗后可以回收，因为剪下的组织只是变小了，组织还是原来的组织，只是外面粘了一层。

6.关于切片（包括石蜡和冷冻）的操作，我几乎没有提到切片机的具体操作步骤，比如切片机如何开机，刀夹如何开合，切片如何调整厚度等。原因是这些操作与具体型号有直接关系，如果你能找到切片机使用，你当然可以找到会用机器的人来教你如何使用它。