O.C.T.胶怎么做冰冻切片?发表时间:2023-04-08 10:09 医务工作者的聚会不是萝卜的聚会,融合创新才是硬道理! 在上一讲中,我们谈到了如何进行石蜡切片。 本次讲座,我们将继续讲述如何进行冰冻切片。 冷冻切片 如果说石蜡切片可以切得很大胆动物切片,那么冰冻切片就比较局限了。 有什么限制? 答案是:温度。 从字面上看,冷冻切片当然需要比较低的温度,一般为-20℃(-20℃)。 所以冰冻切片的**步准备是打开冷冻切片机进行预冷。 在切片机预冷的一两个小时内,我们可以做其他准备工作,包括:刀片、载玻片(防脱)、OCT胶水、镊子、卷纸、铅笔(这里有一个重要的小动作,请看提示 1). 切记也要在切片机中预冷刀片和镊子,但载玻片不行! 想! 放! 让我解释一下原因。 刀片、镊子和载玻片都与 OCT 胶水直接接触。 OCT 胶水在室温下为液体,在-20°C 下为固体。 我们也说过OCT胶是用来包裹组织外面,帮助切片成型的,所以我们希望理想的状态是切片时刀片和镊子接触OCT胶,保持胶的固态,以保证切片平滑,载玻片在贴片时接触OCT胶水,可瞬间将胶水融化成液态,帮助组织快速粘附在载玻片上。 所以为了实现这个理想,我们需要将刀片和镊子预冷至-20°C,同时将载玻片保持在室温。 图1 冷冻切片机预冷后动物切片,先穿上一件长袖的、较厚的白大衣,尤其是在夏天,因为我们的两只手臂要伸入切片机的-20°C区域进行操作,而且持续时间一般是以小时计算的。 做好保护后,将纸巾从冰箱中取出,放入切片机中低温保存。 在冷冻切片的**步中,组织被固定在冷冻切片机上。 首先取一个自己喜欢的冷冻头(冷冻头一般有好几个,如图2),然后就是一个操作,这个是我自己发明的。 骄傲了好几年,现在无私的向所有fans开放,那就是在冷冻的头上夹一个自制的OCT胶水模具(这个神器怎么做,请参考Tip 2,外观工件如图 3 所示)。 这个整形器是做什么用的? 让本夏解释一下。 由于组织和冷冻头都是固体,如果我们要将组织固定在冷冻头上,就必须使用液体OCT胶将组织“粘”在冷冻头上。 这一步的具体操作是用镊子将组织夹在冷冻头上,然后挤一些OCT胶完全淹没组织,然后将冷冻头放回冷冻头架上,耐心等待OCT凝胶凝固. 一旦 OCT 凝胶完全凝固,此步骤就完成了。 说了半天,好像不需要OCT glue ,着急啊。 由于OCT胶是凝胶状的,挤到冷冻头上时其边缘是不规则的,导致切片时难以形成规则完整的形状,导致切片不顺畅。 所以此时如果我们使用OCT胶水成型器,我们可以得到边缘整齐的圆形切片,就像方形石蜡切片一样。 图2 冷冻头 图 3 OCT 凝胶形成器 准备标本,将冷冻头和标本固定在切片机上,装上刀片(注意事项参照石蜡切片),开始修片。 是的,冰冻切片也需要修整。 修整中使用的切片厚度可以是 10 μm、15 μm 或更厚。 因为冰冻切片容易融化开裂(这是我的理解),所以官方切片的厚度比石蜡切片稍厚,一般为5μm,甚至有人用10μm。 与石蜡切片不同,每个冰冻切片都是独立切割的(参见此处的提示 4),不会首尾相连,便于修补。 然而,真正方便冰冻切片上片的步骤并不在这里,而是冰冻切片的精髓——冷冻。 刚才我们说了,OCT胶在常温下是液态,-20°C下是固态,所以固态的OCT胶在常温下遇到载玻片,马上就融化了。 这个过程自然地吸收载玻片上的组织。 然后制作冰冻切片。 不需要立即染色的冰冻切片可放入切片盒中并在 -80°C 下保存,直到您记住它们。 关于切片我们已经说了很多。 下一讲,我想告诉大家如何做免疫组化染色。 1.准备工作中列出的所有项目均不包括冷冻头,因为冷冻头默认始终放置在切片机中。 如果小伙伴用过的切片机冷冻头每次用完就拿出来存放(很多公用切片机都会采取这种方式防止私用),请记得预冷切片机时把冷冻头放好. 一起放入切片机预冷,道理同刀片和镊子。 2、前方高能:本夏自制OCT胶水成型机。 取一个20ml的注射器,取下针头和针芯,刻度管留在外面。 请注意,我们需要的是装有针芯的那一端(即注射时食指和中指接触的那一端),而不是装有针头的那一端。 接下来,找一把美工刀或剪刀剪断管子。 低2cm左右,自制的OCT涂胶机就做好了。 最后,找两个最小的长尾夹,将塑形器夹在冷冻头上使用。 每次想起这个神奇的操作,我都忍不住暗自称赞。 3. 冷冻切片机中的多个冷冻头实际上是为了节省切割多个样品的时间。 我们使用 OCT 胶水将组织“粘”到冷冻切片机上。 等待胶水凝固需要一点时间。 如果我们每次等一块纸巾切完,就把纸巾拿走,然后用卷纸擦拭冷冻切片机。 清洁然后准备下一个样品是浪费时间。 因此,在切割多个组织时,使用所有可用的冷冻头,一次冷冻一批组织,然后每切割一个,就空出一个冷冻头。 ,然后冷冻新组织,这样可以节省时间。 4、切冻片和切羊肉卷本质上是一样的,所以有一个现象是一样的,就是切好的片会卷起来。 因此,切片机自带防卷玻璃板,切好的切片会自动压在玻璃板下压平。 不过玻璃板用久了,切下来的切片不一定能准确的插进玻璃板和刀片的缝隙里,所以直接用镊子夹住切片,不过这个操作有点难度,因为它是边切边切的。 ,也就是当刀片刚切下一点点胶水时,镊子就会夹住切片,然后随着刀片的不断切割,镊子引导切片向下,直到切片被完全切开。 如果有朋友不幸遇到了不好用的玻璃板,同时自己也没有那么巧,可以选择切成卷,等卷掉了,用镊子(**弯头)插入卷筒,打开镊子将卷筒摊开,然后保持镊子支撑卷筒(此时卷筒会挂在镊子上),将卷筒放在载玻片上,效果也一样非常好。 5. 剪下的组织用PBS清洗后可以回收,因为剪下的组织只是变小了,组织还是原来的组织,只是外面粘了一层。 6.关于切片(包括石蜡和冷冻)的操作,我几乎没有提到切片机的具体操作步骤,比如切片机如何开机,刀夹如何开合,切片如何调整厚度等。原因是这些操作与具体型号有直接关系,如果你能找到切片机使用,你当然可以找到会用机器的人来教你如何使用它。 多于!
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