植物切片 本发明与微生物不受损伤的制片技术问题及技术方案介绍

本发明涉及一种植物叶片切片的制作方法，特别是一种延长切片显微观察时间，减少材料自发荧光干扰的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

显微镜观察植物组织细胞时，需要将观察材料切片或压片。 要求植物材料在生产过程中不能对观察材料造成损伤，特别是观察病原微生物侵入宿主时。 正常的活力不应将生产造成的植物组织损伤与病原体感染造成的损伤混淆。 因此，保证宿主和微生物不被破坏的生产方法对于观察病原体的感染过程非常重要。

目前常用的切片方法是石蜡切片，但切片过程中需要进行化学处理，会对细胞组织和病原微生物造成损伤。 与石蜡切片相比，低温切片在制作切片时无需对叶片进行任何其他化学处理，可**限度减少对植物组织的损伤，对病原微生物无害； 另外，低温恒温器的速冻功能可以使叶片快速冷冻，取样后立即切片，可以使叶片保持冷冻时最原始的状态，同时保持细菌在叶片中的形状和位置。留下最原始的状态。 但冰冻切片解冻后容易快速干燥，使组织变形，观察时间迅速缩短。 观察到的实验图片的质量。 因此，需要改进制备技术，减少对植物材料的损伤，不影响植物和病原微生物的生存，减少自发荧光的影响，延长切片的显微观察时间。

技术实现要素：

[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，尤其是克服现有技术中冷冻切片易快速干燥、解冻切片后产生自发荧光的不足，提供一种方法用于制作植物叶片切片，可增加叶片表面活性，延长切片观察时间，保证观察时材料湿润，尽量减少自发荧光。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种植物叶片切片的制作方法，在切片过程中加入非离子表面活性剂Tween-20的水溶液。

进一步地，用于压片的非离子表面活性剂Tween-20的水溶液的体积浓度为Tween-20<0.1%，优选为0.03%~0.06%（研究表明，当非离子表面活性剂Tween-20的体积浓度较小时小于0.1%，为受试者的安全浓度），用量为50μl～100μl。

具体制备方法如下：取适量植物材料于载玻片上，滴加非离子表面活性剂Tween-20水溶液，用盖玻片和封口膜封片。

研究表明，非离子表面活性剂具有低毒、用量小、增溶、乳化、润湿作用，对维持细菌和植物组织的活力具有重要作用。 在未经表面活性剂处理的切片中植物切片，植物组织容易脱水、褐变和皱缩。 本发明通过加入非离子表面活性剂-Tween-20的水溶液来保持材料的活性，**限度地减少材料的失水和收缩； 用激光共聚焦显微镜或其他显微镜观察材料时，标有荧光菌的压片有效观察时间长达18小时，荧光维持2天，几乎没有自发荧光观察图像中的植物叶子。

本发明的植物叶片切片的制作方法在切片时只需加入Tween-20水溶液即可，特别适用于柑橘类叶片的切片制作，操作简单。

图纸说明

图1、图2为实施例1在10倍物镜下经0.03％表面活性剂处理后的截面图； 图3、图4为实施例1中10倍物镜下未经表面活性剂处理的剖面图；

图3左图中，除侵染菌发出的荧光外，其余荧光为植株受害后的自发荧光（图中椭圆标记）； 图4中黑色部分（箭头所指）为脱水后的植物组织褐变形态，以及叶组织皱缩（图中长方形所标示）。

详细方法

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

示例 1

柑橘溃疡病（ ，CBCD）是影响全球柑橘产业发展的重大病害，其病原菌为 citri var. 柑橘 (citri susp. citri, Xcc)。 成功附着在宿主表面后，溃疡病菌必须侵入植物组织才能引起疾病。 因此，病原菌侵入宿主的过程是致病性的关键环节。 观察溃疡病在柑橘寄主体内的侵染定植过程，对于防治柑橘溃疡病和选择抗病品种具有重要意义。 为了观察溃疡病病原菌在柑橘寄主体内的侵染定植过程，需要对植物叶片进行切片，从纵切面和横切面观察叶片发生溃疡病的位置。

本例将溃疡病菌溶液接种于冰糖橙叶片表面，取接种后的冰糖橙叶片切片，利用激光共聚焦观察叶片组织中溃疡病菌的分布情况扫描显微镜（CLSM）。 具体包括以下步骤：

1）病原接种：在冰糖橙活叶上接种5μl浓度为/ml的绿色荧光蛋白（eGFP）标记的口腔溃疡菌。

EGFP标记的溃疡病菌的获取方法参见，发明名称“一种实时观察柑橘溃疡病菌侵染过程的方法”。

2）切片的制备：用手术刀在低温恒温器的速冻盘上取一个2mm×2mm的正方形叶盘，加入适量的胶水，使叶盘直立嵌入胶水中，迅速放置将其在低温恒温箱中快速冷冻。 定型后，用冰冻切片机切出7μm厚的切片，置于载玻片上，加入50μl体积浓度为0.03%的非离子表面活性剂-Tween-20水溶液, 并用盖玻片   密封。

3)荧光标记细菌的CLSM观察使用ZEISS CLSM 710带I3滤光片的倒置显微镜(BP 450-490、DM510、LP515)对样品进行照明，用10×0.40、20×0.70和63×Oil物镜观察。 用 488 nm 激光激发选定位点，检测 500 nm 至 530 nm 波段的荧光，并在 600 nm 至 800 nm 之间调整带宽以检测样品的自发荧光。 将通道设置值的大小调整到**，拍照保存。

切片的观察结果示于附图中。 用Tween-20处理后的切片没有明显皱缩植物切片，基本没有褐变，叶片保持湿润（图1、图2）； 未添加Tween-20的切片中，冰糖橙的叶片组织因脱水而皱缩严重变褐（图4）； 添加Tween-20可以**限度地减少叶子的自发荧光，图中除了荧光细菌的荧光外几乎没有荧光。 检测到额外的荧光（图 1）； 然而，由于植物材料脱水造成的损坏，未经处理的部分会产生大量自发荧光（图 3）。 实验证明，加入本发明的Tween-20可使切片的观察时间延长至18小时，而未加入Tween-20的切片只能维持4小时左右，本发明的方法可大大延长观察时间。 而且，本发明只需要在制作切片时加入适量的Tween-20，操作方便，显着提高了切片的观察效果。